24 años de existencia compartida se truncan dolorosamente; la pérdida trágica de su hijo mayor, después la muerte de Gastón,acaecida en 1598. Juana asume con fortaleza y serenidad suviudez. Con lucidez y valentía, acepta el designio de Dios sobre su vida, teniendo ante sus ojos a Jesucristo cargado con la Cruz. Los necesitados ocupan una gran parte de su corazón y de su tiempo.
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La "llama" que Dios encendió en su corazón urge a Juana, una vezsituados sus hijos, a consagrarse por entero al servicio de Dios. La despedida de sus hijos es muy dolorosa... El 11 de junio de 1603comienza su noviciado en las Fuldenses de Tolosa (Francia).
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Impulsada por un ardiente celo apostólico, por un deseo radical de seguir a Jesucristo, su gran amor a la Iglesia ycon una gran sensibilidad a las necesidades de su tiempo, funda la ORDEN DE LA COMPAÑÍA DE MARÍA NUESTRA SEÑORA, paral a educación cristiana de la JUVENTUD. Colabora en su direcciónespiritual el Padre Juan de Bordes, jesuita.
En 1606 Juana concinco compañeras inagura la casa del ESPÍRITU SANTO:COMUNIDAD DE FE, DE VIDA y DE MISIÓN.